“ 神经科学的进步与细胞成像的进展密切相关。17 世纪显微镜的发明首次允许在细胞水平上对人脑进行表征，并在 18 和 19 世纪出现了临床神经病学、神经外科和精神病学。同样，对神经退行性疾病的理解和分类也得益于 20 世纪下半叶免疫染色技术和多通道荧光成像的发展。然而，尽管取得了这些进展，衍射屏障仍然是传统光学显微镜的分辨率限制，阻碍了亚细胞结构的精确表征。在传统的荧光显微镜中，所有被照射的分子在衍射极限体积内同时发出信号，从而限制了最终获取图像的空间分辨率。 ”
近些年，超分辨率显微镜技术克服了这一障碍，使用不同的方法来区分位于同一衍射极限体积内的荧光分子。其中之一称为随机光学重建显微镜 (STORM)，它基于单分子定位，通过在不同时间点随机打开衍射受限体积内的光开关荧光分子，因此它们的信号基本上不会重叠。当在空间中隔离时，可以通过定位其信号的中心位置来确定每个单独荧光团的位置。然后从随时间累积的众多分子定位生成超分辨率图像，提供 < 50 nm 的空间分辨率。
在神经科学领域，这项新技术导致了神经元轴突细胞骨架周期性结构的表征和突触蛋白的空间组织。在这项研究中，研究者将用细胞成像技术与神经病理学技术相结合，对来自对照受试者和常见年龄相关神经退行性疾病患者的人脑样本进行 2D、3D 和双色 STORM。
《STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain》
NO.1研究结果（节选）
1、使用 STORM 对人脑样本进行超分辨率成像
为了评估人脑组织的 STORM 成像，我们首先旨在解析明确其组织学结构，例如新皮质轴突束。来自对照受试者的前额叶皮层的冷冻样本通过标准的低温恒温器方法切割， 并用抗神经丝一抗和与 Alexa Fluor (AF) 647 偶联的二抗进行免疫染色。对带有免疫染色脑切片的盖玻片放置在配备高功率激光模块、全内反射荧光 (TIRF) 系统和电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 单光子敏感的倒置电动显微镜的载物台上（图1A )。
图1. 使用 STORM 对人脑样本进行超分辨率成像
STORM 在人脑切片中对神经丝 (NF) 免疫染色的皮层轴突的采集：首先获得传统的宽视场荧光显微镜图像 (B1)，然后强烈增加激发功率以诱导荧光团闪烁，并产生数千帧图片（B2-B5）。在每帧基础上以亚像素精度 (B6-B9) 检测激活的荧光分子的定位。然后使用来自所有帧的累积定位来重建超分辨率图像（B10）。
2、人脑样本的 3D-STORM 和双色 STORM 成像
三维 (3D) 和多通道成像提供了对纳米级结构的结构组织的深入了解成为了可能。为了在人脑切片中执行 3D-STORM，研究者使用了一种基于散光的方法 。在显微镜的检测路径中设置柱面透镜后，从其图像的椭圆度确定每个荧光分子的z坐标。对照受试者的前额叶皮质样本对神经丝 (NF) 进行免疫染色，重建后，轴突以高分辨率和约 0.5 µm 的成像深度在 3D 中可视化（图2A)。轴突束的圆柱形状是可辨别的，并且 3D 建模轴突的纵向和横向截面的尺寸与 2D-STORM 获得的尺寸相似。
然后，为了评估皮层样本的双色 STORM 成像，研究者使用两种检测附近结构的一抗（突触前和突触后巴松管和荷马 1 蛋白）以及与光开关荧光团 AF 647 和 AF 532 偶联的二抗对人脑切片进行免疫染色（图2B)。在传统的荧光显微镜下，巴松管和荷马 1 信号出现弥散和重叠，突触间隙无法精确定义。相比之下，双色 STORM 准确区分了由突触间隙分隔的突触前和突触后蛋白簇，并定义了突触的大小、方向和组织。有趣的是，也可以实现将传统的宽视场荧光显微镜和 STORM 相结合的多通道成像，允许使用光可切换和非光可切换荧光团对大脑结构进行超分辨率成像。尽管不如双色 STORM 特异性，但该技术提供了有关相邻结构布局的有价值信息，例如轴突束周围的髓鞘（图 2C)。超分辨结构的尺寸与在相同区域使用 TEM 测量的尺寸相当（图2B3,C3）。
图2.人脑生理结构的 3D-STORM 和双色 STORM 图像
3、淀粉样蛋白-Β 和 TAU 蛋白病的 STORM 成像
阿尔茨海默病 (AD) 是痴呆症的主要原因。该疾病的两个主要标志是 Aβ 肽的细胞外沉积物，其中一些构成了老年斑的核心，以及称为神经原纤维缠结 (NFT) 的过度磷酸化 tau 蛋白 (p.Tau) 的神经元内聚集体。由于聚集体的尺寸可达 100 µm，因此保持整个病变的整体视图对于研究大脑中的 Aβ 和 Tau 病理学至关重要，而高分辨率成像对于表征错误折叠蛋白质的纳米级组织是必不可少的。
研究者使用 STORM 对整个老年斑和退化神经元进行了成像。来自 AD 患者的前额叶、顶叶和颞叶皮层的组织样本针对 Aβ 和 p.Tau（磷酸 Ser202、Thr205）进行了免疫染色。获得了~30 μm 直径的老年斑和~15 μm 具有 NFT 的退化神经元的 STORM 图像。虽然 Aβ 原纤维和 Tau 的成对螺旋丝不能像 TEM 一样被识别，但 STORM 图像提供了 Aβ 和 p.Tau 聚集体的纳米级分布和尺寸的高分辨率细节（图 3 )。神经元内 p.Tau NFT 看起来更密集，胞体中具有蜂窝状结构，轴突中具有丝状组织。聚集体中未染色点的存在表明包含其他成分，如蛋白质或细胞器。这些结果强调 STORM 可用于以高分辨率对 AD 患者脑样本中的 Aβ 和 p.Tau 聚集体进行成像。
图3.人脑生理结构的 3D-STORM 和双色 STORM 图像
4、路易斯病理学的 STORM 成像
帕金森病 (PD) 和路易体痴呆 (DLB) 是两种神经退行性疾病，其特征是存在神经元内磷酸化的 α-突触核蛋白 (p.α-syn) 免疫反应性包涵体，称为路易体 (LB) 。LB 的结构根据它们在中枢神经系统中的定位而变化。通过免疫组织化学可以观察到两种主要的 LB 类型：典型的路易小体 (TLB)，其核心苍白，周围环绕着主要在脑干中的致密晕圈，以及较小的皮质路易小体 (CLB)，缺乏中央核心，主要在新皮质中检测到. 也可以观察到 p.α-syn 在称为路易轴突 (LN) 的营养不良轴突中的积累。迄今为止，LB 的结构仍不清楚，因为传统荧光显微镜的分辨率太低，无法表征其内部结构，并且 TEM 无法提供有关其蛋白质含量和组织的足够信息。
为了使用分子染色方法在纳米级表征 LB 组织，研究者对来自 PD 和 DLB 患者的脑样本进行了 STORM 成像。用抗 p.α-syn（磷酸化 Ser129）抗体对黑质和前额叶皮层切片进行免疫染色，并获得 TLB、CLB 和 LN 的图像。尽管只有 STORM 图像精确定义了它们的结构，但在常规和超分辨率成像中均观察到 TLB 的环形外观（图4A）。苍白的核心看起来没有染色，而外围的致密晕是由网状 p.α-syn 构成的。同样，CLB 的 STORM 成像揭示了传统荧光显微镜无法观察到的致密蜂窝结构（图 4B,4C）。至于 p.Tau 聚集体，在 LB 中观察到的未染色核心和斑点可能对应于蛋白质伙伴或被困细胞器。
图4. PD 和 DLB 患者脑样本中路易体的 STORM 图像
事实上，路易体是由 100 多种蛋白质组成的多蛋白复合物，包括 p.Tau 。因此，我们使用针对 p.Tau 和 p.α-syn 的抗体对 LB 进行了双色 STORM像，以精确定义病变的内部结构，并明确区分一种蛋白质与另一种蛋白质（图 5A）。STORM 成像准确测量了聚集 p.α-syn 分支的宽度和在 CLB 中观察到的未染色核心面积（图 5B）。最后，LN 的双色 STORM 成像揭示了神经突的内部组织，其中包含与神经丝结合的聚集 p.α-syn 核心（图 5C )。这些 p.α-syn 聚集体的第一批 STORM 图像为表征人类大脑中路易病理学的组成和空间组织提供了广阔的前景。
图5. 路易体和路易神经突的共定位和超微结构分析
NO.2研究总结
在这项工作中，研究者结合超分辨率显微镜和神经病理学技术来分析人脑切片。该策略以 <50 nm 分辨率表征生理结构（如轴突和突触）的结构，并以前所未有的细节对来自神经退行性疾病患者的样本中的 Aβ、Tau、α-突触核蛋白和 TDP-43 病理聚集体进行成像。
迄今为止，组织中纳米结构成像的主要方法依赖于透射电子显微镜，这是一种耗时的技术，需要具有严格样品制备的超薄组织切片（50-70 nm），并限制免疫靶向多样性和 3D 采集。相反，STORM 在样品制备、广阔的观察视野、多分子标记和 3D 采集方面提供了光学荧光显微镜的优势，图像采集和重建只需几分钟。在这项工作中开发的用于人脑组织观察的样品制备工作流程既省时又易于重现。
双色STORM允许突触的分子结构的可视化，精确地识别前和突触后蛋白簇和限定它们的尺寸，形态和取向。STORM 还用于对阿尔茨海默病小鼠模型中的病理性 Aβ 聚集体进行成像，其结果与我们在人类中的结果相当，无论是斑块形态还是 Aβ 原纤维宽度，范围从 50 到 300 nm最后，帕金森病小鼠模型中 α-突触核蛋白聚集体的 STORM 成像允许可视化多巴胺能神经元中的 α-突触核蛋白聚集。
通过揭示以前没有被可视化的新结构和特征，固定人体组织样本的 STORM 成像为更全面地了解人类大脑组织和揭示常见神经系统疾病的潜在机制打开了进一步的大门。这项技术的便利性应该为 STORM 应用程序的直接扩展开辟了人类大脑样本的超分辨率成像，为当前神经科学的挑战提供了有希望的新途径。
参考文献References
1. Codron, P., F. Letournel, S. Marty, L. Renaud, A. Bodin, M. Duchesne, C. Verny, G. Lenaers, C. Duyckaerts, J. P. Julien, J. Cassereau, and A. Chevrollier. 2021. 'STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain', Neuropathology and applied neurobiology, 47: 127-42.
力显智能现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM，成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实，从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
